Ciąża, pierwotny Aldosteronizm i Mutacje Adrenal CTNNB1 cd..

Te gruczolaki kontrolne wybrano ze względu na ich wcześniejsze włączenie do półilościowej analizy histologicznej typu komórki.10,12 Analiza funkcjonalna mutacji CTNNB1
Po wytworzeniu mutantów p-kateniny (Ser33Cys, Gly34Arg i Ser45Phe) za pomocą mutagenezy ukierunkowanej, zmierzono aktywność Wnt-.-kateniny za pomocą testów reporterowych lucyferazy TCF / LEF. Stabilizację mutantów wykazano za pomocą metody Western blotting, przy użyciu przeciwciała monoklonalnego, które wykrywa transkrypcyjnie aktywną postać .-kateniny (patrz sekcja Metody w dodatkowym dodatku).
Ex Vivo Badania nad powstawaniem gruczolaków produkujących aldosteron
Test mikromacierzy przeprowadzono na 42 próbkach RNA (14 triach próbek z gruczolaków, sąsiadującej zona fasciculata i przyległej zona glomerulosa, w tym próbkach od Pacjenta 1). Patrz rozdział Metody w Dodatku Dodatkowym) .12 Ekspresja genu w gruczole Pacjent 3 był wcześniej badany za pomocą mikromacierzy.10
Mierzono poziomy mRNA genu LHCGR, GNRHR i gonadalnego czynnika transkrypcyjnego GATA4 (mRNA) w gruczolakach i sąsiadującej tkance nadnerczy od wszystkich trzech pacjentów, stosując ilościowy test reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) z określonymi starterami. Analizę immunohistochemiczną przeprowadzono na utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawkach nadnerczy (4 .m grubości) dla .-kateniny (BD Biosciences) i LHCGR (Sigma). Aby potwierdzić bezpośredni wpływ mutacji CTNNB1 na ekspresję receptorów hormonu luteinizującego i ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej, barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono na komórkach gruczolakowatych podobnych do zona glomerulosa po transfekcji CTNNB1 typu dzikiego lub zmutowanego (patrz sekcja Metody w dodatkowym dodatku ).
Wyniki
Identyfikacja mutacji w Exon 3 CTNNB1
Sekwencjonowanie całego genomu gruczolaka wytwarzającego aldosteron od Pacjenta wykazało heterozygotyczną mutację somatyczną (C . G, p.Ser33Cys) w eksonie 3 CTNNB1. Mutacja w CTNNB1 była nieobecna w dziewięciu gruczolach kontrolnych pochodzących od mężczyzn i kobiet, które nie były w ciąży. Sekwencjonowanie Sanger zidentyfikowało heterozygotyczne mutacje w tym samym eksonie CTNNB1 w gruczolakach produkujących aldosteron u pozostałych dwóch pacjentów (C . T, p.Ser45Phe, w Pacjent 2 i G . A, p.Gly34Arg, w Pacjent 3) (ryc. S2 w dodatkowym dodatku).
Zmutowane .-Cateniny i szlak Wnt
Figura 2. Figura 2. Względna aktywność TCF / LEF i immunobloty po transfekcji kontrolą i konstrukty CTNNB1. Figura A pokazuje względną aktywność TCF / LEF, mierzoną jako stosunek lucyferazy świetlika do renulowanej lucyferazy, z użyciem TCF znakowanego lucyferazą. Promotor reagujący na LEF w komórkach HEK293T. Wyniki pochodzą z pięciu eksperymentów przeprowadzonych 48 godzin po transfekcji pustym wektorem i dzikiego typu i zmutowanych konstruktów CTNNB1. I słupki wskazują błędy standardowe, a P <0,001 dla wszystkich porównań zmutowanych konstruktów z dzikiego typu CTNNB1. Panel B pokazuje immunobloty dla aktywnej endogennej .-kateniny w komórkach HEK293T 72 godziny po transfekcji pustym wektorem i dzikiego typu i zmutowanymi konstruktami CTNNB1. Wartości są wartościami procentowymi całkowitej endogennej .-kateniny, która była aktywna (tj. Nie fosforylowana przy resztach Ser33, Ser37 i Thr41) [patrz też: niacynamid, Kabiny Sanitarne, dygestorium ]

Powiązane tematy z artykułem: dygestorium Kabiny Sanitarne niacynamid